T 淋巴细胞分离技术

ficoll-hypaque 混合溶液，又称淋巴细胞分层液，在分离人 PBMC 时，要求其比重为 1.077；分离小鼠单个核细胞时比重为 1.080；分离大鼠单个核细胞时比重为 1.084 ~ 1.087；分离马单个核细胞时比重为 1.090。

pH7.2 Hanks 液、肝素、生理盐水水溶液，淋巴细胞分层液。(8.2%的聚蔗糖溶液 28 份，35.7%泛影葡胺 10 份)

1.静脉取血 2ml，加入含肝素溶液(10 ~ 50u / ml 血样本)的试管中，混匀，使血液抗凝。用 pH7.2 Hanks 液或生理盐水将抗凝血稀释 1 倍。

2.吸取 2ml 淋巴细胞分层液置于刻度离心管中，然后将离心管倾斜 45°角，用毛细滴管将稀释的全血沿管壁缓慢加至分离液上面，应注意保持两者界面清晰。

3.在 18°C ~ 20°C下，用水平离心机以 2000r/min 离心 20min。

4.用毛细吸管轻轻插到混浊带，沿管壁轻轻吸出此层细胞，移入另一支离心管中。即要吸取所有单个核细胞，又要避免吸取过多的分层液或血浆，以免混入其他细胞成分。

5.用 Hanks 液洗涤细胞 3 次。第一次 2000r/min，10 min；第 2 ~ 3 次 1500r/min，10 min，可去掉大部分混杂的血小板。

6.将沉淀细胞悬于培养基中备用。

1、实验所用玻璃器皿应该洁净。如果制备的单个核细胞悬液用于细胞培养时，上述操作过程都要在无菌条件下进行，所用器材、试剂都应为无菌。

2、实验中的细胞得率与室温及分层液比重等有关。分层液应避光 4°C保存。

3、往淋巴细胞分层液中加入稀释全血时，不得将血液冲入分离液中，须保持两层液体的清晰界面。

以下介绍免疫磁珠间接法分离淋巴细胞（正选法）（以 Immunotech 公司产品为例）。

连接有磁珠的二抗，抗体 (一抗)、PBS+0.2%BSA、PBS+1.2%BSA、PBS+30%FCS、磁架、玻璃管等。

1.取适量磁珠悬液，用 20 倍体积的 PBS+0.2%BSA 溶液重悬后，置磁架上 5min。(磁珠与单个核细胞或全血的比例为：0.5mg 磁珠/1×10⁷个单个核细胞或 1ml 全血)

2.吸去上清，以去除在储存过程中从磁珠上脱落的二抗。用 100ul PBS+0.2%BSA 溶液重悬磁珠。加入一抗 (一抗与磁珠的比例为：5ug 一抗/1mg 磁珠)，置室温 15 min，中间轻微晃动二次。再置磁架上 5min。

3.加入 2ml PBS+1.2%BSA 溶液，再置磁架上 5min。吸去上清，以去除未与二抗结合的一抗。重复操作一次。用 100ul PBS+0.2%BSA 溶液重悬磁珠。

4.用 PBS+30%FCS 调整待分离细胞的浓度为 1×10⁷细胞/ml，将细胞加入磁珠悬液中，置室温 10min，中间轻微晃动一次。然后置磁架上 10min。吸去上清。

5.用完全培养基重悬磁珠结合的细胞后直接进行培养。

1.若采用负选法分离细胞，磁珠与细胞比例为：1mg 磁珠/1×10⁷单个核细胞或 1ml 全血。

2.待分离的细胞悬液应尽量是单细胞悬液，避免细胞粘附成团，以免影响分离效果。

① 选用与血清瓶同规格的对照瓶一个。

② 对照瓶内放入与血清等体积的水。

温度预试：对照瓶内插入 2—3 支经挑选的温度计(保证测试温度的准确性)，放入水浴箱中，接通电源，调节温度控制钮，使水浴箱温度所示温度保持在 56°C。

④ 血清灭活：血清瓶与带温度计的对照瓶一齐放入水浴箱中，待温度计所示温度上升至 56°C时，定时 30 分钟。

⑤ 大瓶血清灭活后，进行分装

保存 分装后，抽样做无菌试验，- 20 ~ - 70°C保存。