细胞爬片荧光TUNEL凋亡检测

爬片预处理：爬片提前高压灭菌，用多聚赖氨酸包被处理（防掉片关键），无菌晾干后备用；优先选择共聚焦小皿，可省去爬片转移步骤，降低掉片风险。

细胞铺片：取对数生长期细胞，接种于预置爬片的6孔板/共聚焦小皿，细胞密度控制在70%-80%，待细胞完全贴壁、状态良好后，进行给药/造模处理。

试剂准备：所有PBS、缓冲液提前恢复至室温；蛋白酶K、破膜液、DAPI、TUNEL试剂盒试剂均避光保存，TUNEL反应液现配现用，不可提前配制储存。

实验器材：准备湿盒、脱色摇床、组化笔、抗荧光淬灭封片剂、DNase I（阳性对照用）。

造模结束后，弃去培养基，用预冷PBS轻柔清洗细胞1次，去除残留血清和细胞碎片；

每孔加入4%多聚甲醛，室温固定15-20min；

弃固定液，将孔板置于PBS中，脱色摇床低速晃动洗涤3次，每次5min，全程操作轻柔，避免直接冲淋细胞。

爬片稍甩干（勿完全风干），用组化笔在细胞分布均匀区域画闭合圆圈，防止工作液流失；圈内滴加现配蛋白酶K工作液（原液:PBS=1:9），完全覆盖细胞，放入湿盒，37℃温箱孵育10min；之后PBS摇床洗涤3次，每次5min。

滴加50-100μL 0.1% Triton X-100破膜工作液，室温避光孵育20min；PBS洗涤3次，每次5min，洗去残留破膜液。

爬片轻甩多余PBS（勿吸干细胞），圈内滴加TUNEL平衡Buffer覆盖细胞，室温湿盒避光孵育10min，保障后续酶促反应环境。

按TDT酶:dUTP:Buffer=2:5:50的比例，轻柔混匀配制反应液，滴加至圈内完全覆盖细胞；置于避光湿盒，37℃恒温箱孵育1小时，严格控制孵育时长，避免信号异常。

PBS缓冲液洗涤3次，每次5min，彻底洗去未结合的反应试剂；去除PBS后滴加DAPI染液，全程避光，室温孵育10min。

PBS缓冲液终洗3次，每次5min；爬片稍甩干，用吸水纸轻吸圈外液体，勿触碰细胞面，将细胞面朝下，用抗荧光淬灭封片剂无气泡封片，封片后可用指甲油密封边缘。

荧光显微镜下采集图像：DAPI经紫外激发，细胞核呈蓝色；488荧光素标记的凋亡阳性细胞核呈绿色，凋亡细胞可见核固缩、碎裂，Merge图可直观区分正常与凋亡细胞。

阳性对照：固定后的细胞样本用DNase I 37℃消化15-30min，人为断裂DNA暴露3'-OH，后续按相同流程操作，最终应出现大量绿色阳性信号，验证试剂与操作有效性。

阴性对照：配制TUNEL反应液时不添加TDT酶，仅保留dUTP和Buffer，其余步骤一致，正常无绿色荧光，排除非特异结合与自发荧光干扰。

荧光淬灭防控：从破膜步骤开始全程避光操作，所有孵育步骤在湿盒内进行，防止液体蒸发，封片后2小时内完成拍照，4℃避光短期保存，24小时内完成检测。

蛋白酶K操作：用量需精准，以完全覆盖细胞为宜，过多易外溢，过少导致消化不均，出现结果“阴阳脸”。

防掉片核心技巧：细胞状态不佳不铺片，洗涤、加液时沿孔壁缓慢操作，避免高速摇床、直接冲淋细胞；原代细胞等脆弱样本，直接用共聚焦小皿完成全程实验。

试剂与操作区分：荧光TUNEL实验无需封闭，仅白光免疫组化需要封闭；严禁剧烈震荡混匀试剂，避免酶活性失活。