固定化金属螯合层析（IMAC）- His标签蛋白纯化SOP
基于固定化金属螯合层析技术，通过镍离子与组氨酸标签的特异性结合，纯化重组His标签蛋白的标准化操作流程，涵盖柱再生、样品制备、平衡、上样、洗涤、洗脱及保存步骤。
内容预览
实验原理、物品准备与技术路线概览
2 步骤
1.1 实验原理
固定化金属螯合层析是一种基于金属离子与特定氨基酸侧链（如组氨酸的咪唑基）之间配位作用的亲和层析技术。在His标签蛋白纯化中，将镍离子（Ni²⁺）固定在层析介质（如琼脂糖凝胶）上形成金属螯合物。目的蛋白携带的组氨酸标签（His-tag）通过其咪唑基团与Ni²⁺形成配位键，从而特异性结合在柱子上。大部分宿主细胞蛋白等杂质因不携带该标签而不被保留，通过低浓度咪唑的洗涤缓冲液即可洗去。最后，通过含有高浓度咪唑的洗脱缓冲液竞争结合Ni²⁺，将目的蛋白从柱子上洗脱下来，实现高纯度分离。
1.2 技术路线概览
层析柱预处理/再生（若需） → 上样前柱平衡 → 样品（含His标签蛋白的裂解液）上样 → 洗涤（去除非特异性结合杂质） → 洗脱（收集目的蛋白） → 柱清洗与保存。
镍柱再生
7 步骤
2.1 ddH₂O冲洗
将层析柱正确连接至泵系统，以1.0 mL/min的流速，用5个柱体积 (CV) 的ddH₂O冲洗柱子。
2.2 EDTA螯合再生
更换为100 mM EDTA溶液 (pH 8.0)，以1.0 mL/min的流速冲洗5 CV，以螯合去除柱上残留的Ni²⁺及杂蛋白。
2.3 去除EDTA
更换为ddH₂O，以1.0 mL/min的流速冲洗5 CV，以去除EDTA。
2.4 NaOH消毒
更换为0.2 M NaOH溶液，以0.5 mL/min的流速冲洗5 CV，以去除残余蛋白并消毒。
2.5 去除NaOH
更换为ddH₂O，以2.0 mL/min的流速冲洗10 CV，彻底去除NaOH。
2.6 重新加载Ni²⁺
更换为100 mM NiSO₄溶液，以0.2 mL/min的流速加载5 CV，使Ni²⁺重新螯合至柱料。
2.7 冲洗游离离子
更换为ddH₂O，以1.0 mL/min的流速冲洗5 CV，去除游离Ni²⁺。再生完成，可立即使用或进入平衡步骤。
His标签蛋白纯化
15 步骤
3.1 菌体沉淀重悬
用5倍菌体沉淀体积的低浓度咪唑平衡缓冲液 (例如：20 mM Tris, 500 mM NaCl, 20 mM 咪唑，pH 8.0) 重悬菌体。
3.2 超声破碎处理
使用超声破碎仪在冰浴中进行破碎。参数需优化，示例：工作3秒，间歇5秒，总时长10-15分钟，至菌液由浑浊变清亮、黏度下降。
10 min
超声总时长
3.3 裂解液离心
将裂解液转移至离心管，于4°C，12,000 ×g (需注明所用转子型号，如F15-8x50cy)，离心30 min。
30 min
离心时间
3.4 上清过滤收集
小心吸取上清液，用0.45 μm滤膜过滤，即得待纯化样品，置于冰上备用。
3.5 层析柱平衡
将再生后或新的Ni²⁺亲和柱连接至泵，用至少5 CV的低浓度咪唑平衡缓冲液 (例如：20 mM咪唑) 冲洗，流速为1.0 mL/min，直至流出液pH和电导稳定。
3.6 样品上样
将2.1.4中准备的样品以较低流速 (例如：0.5-1.0 mL/min) 上样，以最大化结合。
3.7 缓冲液洗涤
上样完毕后，用至少5 CV的低浓度咪唑平衡缓冲液 (同上) 洗涤柱子，流速为1.0 mL/min，以去除非特异性结合的杂蛋白。收集流穿液和洗涤液以备分析。
3.8 梯度洗脱准备
初次纯化未知蛋白时，应采用线性或阶梯梯度洗脱。准备含50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 300 mM咪唑的洗脱缓冲液 (20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0)。
3.9 梯度洗脱执行
依次用每个浓度的洗脱缓冲液冲洗2 CV，流速为1.0 mL/min，并分别收集洗脱峰组分。每个梯度间隔用1 CV平衡缓冲液冲洗。
3.10 洗脱组分分析
通过SDS-PAGE分析各洗脱组分，确定目标蛋白被洗脱的咪唑浓度范围。
3.11 优化后一步洗脱
在后续纯化中，可使用优化的单一浓度 (如步骤2.4.3确定的最低有效浓度) 高浓度咪唑洗脱缓冲液进行一步洗脱，冲洗3-5 CV，收集目标蛋白峰。
3.12 洗脱后清洗
洗脱完成后，立即用含500 mM咪唑的缓冲液冲洗柱子2 CV，流速1.5 mL/min，以去除强结合杂质。
3.13 去盐冲洗
用5 CV的ddH₂O冲洗，流速2.0 mL/min，去除盐分。
3.14 乙醇冲洗
用3 CV的20% (v/v) 乙醇水溶液冲洗，流速1.0 mL/min。
3.15 密封冷藏保存
将柱子两端密封，于4°C保存于20%乙醇中。
常见问题排查
1 步骤
4.1 故障排查参考
| 问题现象 | 可能原因 | 解决方案 |
| 流穿液中目标蛋白含量高 | 1. His标签未暴露或标签被切割。\n2. 结合条件不当 (pH过低、咪唑浓度过高)。\n3. 样品中还原剂 (如DTT, β-巯基乙醇) 浓度过高，还原了Ni²⁺。\n4. 柱载量不足或Ni²⁺脱落。 | 1. 优化裂解条件；Western Blot验证标签完整性。\n2. 确保缓冲液pH为8.0-8.5；降低平衡/洗涤缓冲液咪唑浓度 (可尝试5-10 mM)。\n3. 将还原剂浓度控制在1 mM以下，或使用更稳定的还原剂如TCEP。\n4. 减少上样量；按第一部分再生柱子。 |
| 洗脱组分中目标蛋白纯度低 | 1. 洗涤强度不足，杂蛋白非特异结合强。\n2. 蛋白在柱上发生聚集或降解。\n3. 洗脱条件过于剧烈，将杂蛋白一并洗下。 | 1. 优化洗涤缓冲液：提高咪唑浓度 (逐步提高至30-50 mM)，或添加少量去垢剂、改变盐浓度。\n2. 操作全程保持低温；优化缓冲液配方；缩短纯化时间。\n3. 采用更平缓的梯度洗脱，寻找能洗脱目标蛋白的最低咪唑浓度。 |
| 洗脱峰拖尾或回收率低 | 1. 蛋白与填料结合过强或发生多价结合。\n2. 洗脱不彻底。\n3. 蛋白在洗脱过程中沉淀。 | 1. 在洗脱缓冲液中添加10%甘油或降低pH至7.0-7.5。\n2. 增加洗脱体积或咪唑浓度；使用含500 mM咪唑的缓冲液进行柱再生清洗。\n3. 在洗脱缓冲液中添加温和去垢剂 (如0.1% CHAPS) 或降低洗脱流速。 |
| 柱子背压异常升高 | 1. 样品或缓冲液未过滤，有颗粒物。\n2. 菌体碎片或变性蛋白堵塞筛板。\n3. 柱子装填过紧或滋生微生物。 | 1. 确保所有样品和缓冲液经0.45 μm或0.22 μm滤膜过滤。\n2. 优化样品离心条件；反向冲洗柱子 (流速需低于正向最大流速的30%)。\n3. 若反向冲洗无效，可能需要拆卸清洗筛板或更换柱料。按1.4步骤用NaOH清洗消毒。 |
安全与操作规范
6 步骤
5.1 化学品安全警示
NiSO₄为已知致癌物和致敏物，操作时必须佩戴手套、防护镜和实验服，在通风橱内称量和配制溶液。NaOH具有强腐蚀性，避免皮肤接触。乙醇易燃，远离明火。
5.2 缓冲液配制规范
所有缓冲液必须用0.22 μm滤膜过滤并彻底脱气，使用前需预冷至4°C。pH必须精确调节至8.0 (25°C测量值)，因为Ni²⁺与His标签的结合在偏碱性条件下最佳。
5.3 样品处理要求
样品制备全程需在低温下进行，并使用蛋白酶抑制剂，以防止目标蛋白降解。上样前必须充分过滤，以防堵塞层析柱。
5.4 流速控制规范
上样和结合步骤应使用较低流速，以确保充分的结合时间。洗涤和洗脱步骤流速可适当提高，但不得超过柱子最大耐压。
5.5 柱子维护保养
每次使用后必须严格按照2.5步骤进行彻底清洗和保存，防止蛋白残留和微生物滋生。避免柱子干涸。
5.6 对照实验设置
应设置对照实验以验证纯化效果。建议使用不含His标签的空载载体菌株裂解液作为阴性对照，使用商品化His标签蛋白或已知表达良好的His标签蛋白菌株作为阳性对照，流程与本SOP一致。
来源
小白实验整理 · 官方发布
* 提示：本卡片为官方整理发布，仅用于学术研究与参考，不构成实验操作的安全指南。实验执行前请遵循您所在机构的安全操作规程（SOP）。
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