细胞免疫荧光染色

将洁净的盖玻片（24×24 mm）完全浸没于浓硫酸中，室温浸泡过夜（≥12 h）。

戴好耐酸手套，在通风橱内用镊子取出盖玻片，用超纯水（ddH₂O）在烧杯内超声洗涤5次，每次5 min。或置于烧杯中，用流动的ddH₂O冲洗至少20遍。

将洗涤后的盖玻片转移至无水乙醇中，室温浸泡6 h。

用镊子取出盖玻片，置于洁净的锡箔纸上，放入60°C烘箱中烘干1 h。将烘干后的盖玻片放入玻璃培养皿，用锡箔纸包裹，于121°C高压蒸汽灭菌20 min。灭菌后，在超净工作台内冷却至室温备用。

仅限紧急情况：将盖玻片浸入75%乙醇中，静置15 min。在酒精灯火焰上快速过火2-3次以烘干并灭菌，置于无菌锡箔纸上冷却至室温。

在6孔板各孔底部预先加入20 μL完全培养基。用无菌镊子将预处理好的盖玻片小心放置在液滴上，确保其平整贴附于孔板底部。

用胰酶消化对数生长期的细胞，用完全培养基重悬并计数。调整细胞密度至所需浓度（例如，2-5×10⁴ 个/mL）。

向每个已放置盖玻片的6孔板孔中轻柔加入2 mL细胞悬液。轻轻十字形晃动孔板使细胞分布均匀。

将孔板放入37°C，5% CO₂的细胞培养箱中培养，直至细胞密度达到实验要求（通常为60%-80%汇合度）。

用弯头镊子轻轻夹住盖玻片边缘，将其从孔板中取出。若盖玻片贴附过紧，可使用1 mL注射器针头从边缘轻轻撬起一角后再夹取。

将带有细胞的盖玻片（细胞面朝上）放入盛有PBS的染色皿中，在摇床上以60 rpm洗涤3次，每次5 min。

吸弃PBS，加入足量4%多聚甲醛固定液，确保完全浸没盖玻片。室温避光固定15 min。

吸弃固定液（按有害化学废液处理）。加入PBS，在摇床上以60 rpm洗涤3次，每次5 min。

吸弃PBS，加入足量0.2% Triton X-100透化液，室温孵育20 min。用PBS洗涤3次，每次5 min（摇床，60 rpm）。注：若检测膜表面蛋白，跳过此步骤。

吸弃洗涤液。加入足量5% BSA封闭液（或与二抗同源的10%正常血清封闭液），确保完全覆盖样本。室温孵育1 h。

用封闭液按说明书推荐比例稀释一抗。用吸水纸吸干盖玻片边缘液体，将盖玻片（细胞面朝下）反扣在已滴加50-100 μL一抗稀释液的封口膜上。将此体系放入湿盒中，4°C孵育过夜（12-16 h）。注意：确保液滴与盖玻片完全接触，无气泡。

从湿盒中取出盖玻片，细胞面朝上放回染色皿。用预冷的PBST，在摇床上以60 rpm洗涤3次，每次10 min。

用封闭液按说明书推荐比例稀释荧光二抗。避光条件下，重复步骤4.3的操作，将盖玻片反扣在50-100 μL二抗稀释液上，室温避光孵育1 h。

避光条件下，用PBST重复步骤4.4的洗涤过程，洗涤3次，每次5 min。

避光条件下，向盖玻片细胞面滴加足量1 μg/mL DAPI染色液，室温避光孵育5 min。

避光条件下，用PBS洗涤盖玻片3次，每次5 min（摇床，60 rpm）。最后用ddH₂O快速漂洗1次，以去除盐分结晶。

用吸水纸小心吸干盖玻片边缘和背面的液体。在洁净载玻片中央滴加5-10 μL含抗荧光淬灭剂的封片液。将盖玻片（细胞面朝下）轻轻反扣在封片液滴上，避免产生气泡。用滤纸吸去周围溢出的液体。用透明指甲油或封片胶密封盖玻片四周。将制备好的切片置于暗盒中，4°C避光保存，并尽快在荧光显微镜下观察。

使用已知高表达目标蛋白的细胞系或已验证的一抗/二抗组合进行染色。预期结果应为清晰的、与预期定位一致的强特异性荧光信号。

一抗阴性对照：在实验组细胞中，用同种属同型的无关IgG或仅用封闭液替代特异性一抗，其他步骤完全相同。预期结果应为无目标蛋白的特异性荧光信号，仅有微弱的非特异性背景或DAPI核信号。 二抗阴性对照：在实验组细胞中，省略一抗孵育步骤，仅用封闭液孵育后直接进行二抗孵育。预期结果应为无任何荧光信号。 空白对照：细胞不经过任何一抗和二抗处理，仅进行固定、透化、封闭、DAPI染色和封片。用于评估细胞自身自发荧光及封片液背景。预期结果应仅见DAPI蓝色核荧光。

操作浓硫酸、多聚甲醛等危险化学品时，必须在通风橱内进行，并穿戴实验服、手套、护目镜。废液按规定分类收集。 从二抗孵育开始，所有步骤均需严格避光操作。封片须使用抗荧光淬灭封片液，制片后4°C避光保存。 洗涤过程动作须轻柔，液流不得直接冲击细胞面。使用PBST可有效降低背景，但比PBS更容易导致细胞脱落。 一抗/二抗稀释比例需通过预实验优化。孵育时确保液体完全覆盖样本，防止干燥。 每次实验必须设立至少一种阴性对照，以正确判读结果。