YF® Click-iT EdU通用款细胞增殖检测试剂盒

-20°C避光保存，有效期见外包装。开封后，保存温度详见说明书。

取对数生长期细胞，以每孔4×10³-1×10⁵细胞（可根据细胞大小、生长速度以及实验处理的具体要求调整细胞数量和密度）接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。

根据实验需要进行各种药物处理。

(1) 用细胞完全培养基按一定比例稀释 EdU 溶液（组分 A）至合适浓度后加入细胞中，混匀；设置不加 EdU 处理的阴性对照组。

注：EdU 的标记浓度需根据细胞类型加以调整，建议以 10 μM 的初始浓度进行摸索。预实验中，建议设置 EdU 浓度梯度，可参考附表 2 和附表 3。

(2) 细胞培养箱中孵育 2 h。

注：最佳孵育时间与细胞周期有关，大多数肿瘤细胞系均可采用 2 h 的孵育时间，可参考附表 2。EdU 浓度与孵育时间相关，短时间孵育（<2 h）宜采用高浓度，如：10~50 μM；长时间孵育（>24 h）宜采用低浓度，如：1~10 μM；也可参考附表 3。

注：对于需要做细胞表面抗原标记的实验，可以考虑在完成 EdU 孵育后，以含 3% BSA 洗涤液洗涤细胞 2 次，在细胞固定促渗之前进行。

(1) 孵育完成后，去除培养基。以 1X PBS 清洗细胞两次，每次5 min，以除去未掺入 DNA 的 EdU 残留，贴壁不牢的细胞可降低清洗强度。加入50 μL 4% 多聚甲醛固定液，室温孵育20 min后，去除固定液。

(2) 每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸溶液，室温孵育5 min，中和残留的固定液。

(3) 以每孔100 μL 3% BSA洗涤细胞2次。

(4) 去除洗涤液，加入100 μL 0.5% Triton X-100，室温孵育10 min。

注：本参考步骤每个样本使用100 μL的工作液，用户可以根据自己的样本情况调整用量。

(1) 配置1× Click-iT EdU反应缓冲液（组分C）：用ddH2O将组分C稀释10倍。

(2) 配置5× Click-iT EdU缓冲液添加物（组分E）：加300 μL的ddH2O至30 mg的E组分管中（终浓度100 mg/mL），混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在-20°C，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用。

注：不同规格的组分E均按照此比例加ddH2O溶解，制备成5× 储液备用。

(3) 准备1× Click-iT EdU缓冲液添加物：用ddH2O稀释5× Click-iT EdU缓冲液添加物至1×，溶液应现配现用。

(4) 依据表 1 准备 Click-iT 工作液。

(5) 去除促渗剂，每孔100 μL的3% BSA洗涤液洗涤2次。

(6) 每孔加入100 μL Click-iT工作液，均匀覆盖细胞。

(7) 室温避光孵育 30 min。

(8) 除去 Click-iT 工作液，以 100 μL 3% BSA 洗涤细胞 2 次后，去除洗涤液，加入 100 μL PBS 保持细胞湿润。如其他无特别要求，即可进行拍照分析。

(1) 用 100 μL PBS 洗涤细胞 1 次，去除洗涤液。

(2) 用 PBS 将 Hoechst 33342（组分 F）稀释 2000 倍。

(3) 每孔加 100 μL 1×Hoechst 33342 溶液，室温避光孵育 15-30 min。

(4) 去除 Hoechst 33342 溶液，用 100 μL PBS 洗涤细胞 2 次。

建议染色完成后立即进行荧光显微镜拍照观察；如果条件限制，请于 4°C 条件下避光湿润保存 3 天之内完成拍照。

每孔 1×10⁵~3×10⁶ 个细胞接种于6孔板中。

根据实验需要进行各种药物处理。

(1) 用细胞完全培养基按一定比例稀释 EdU 溶液（组分 A）至合适浓度后加入细胞中，混匀；设置不加 EdU 处理的阴性对照组。

注：EdU 的标记浓度需根据细胞类型加以调整，建议以 10 μM 的初始浓度进行摸索。预实验中，建议设置 EdU 浓度梯度，可参考附表 2 和附表 3。

(2) 细胞培养箱中孵育 2 h。EdU 孵育细胞的时间可以直接用作测定细胞 DNA 合成的指标，时间点选择以及孵育的时间取决于细胞生长速率。通过短暂的 EdU 孵育进行的脉冲式标记细胞可以用于研究细胞周期动力学。

注：最佳孵育时间与细胞周期有关，大多数肿瘤细胞系均可采用 2 h 的孵育时间，可参考附表 2。EdU 浓度与孵育时间相关，短时间孵育（<2 h）宜采用高浓度，如：10~50 μM；长时间孵育（>24 h）宜采用低浓度，如：1~10 μM；也可参考附表 3。

注：对于需要做细胞表面抗原标记的实验，可以考虑在完成 EdU 孵育后，以含 1% BSA 洗涤细胞 2 次，在细胞固定促渗之前进行。

(1) 孵育完成后，收集细胞，每管加入1 mL PBS 清洗细胞，1000 rpm离心5 min，吸弃上清，以除去未掺入 DNA 的 EdU 残留。

(2) 每管加入 1 mL 4% 多聚甲醛固定液重悬细胞。

(3) 室温孵育 20 min，1000 rpm 离心 5 min，吸弃上清。

(4) 每管加入 1 mL 2 mg/mL 甘氨酸孵育 5min，中和残留的固定液，1000 rpm 离心 5 min，吸弃上清，每管加入 1 mL PBS 清洗 1 次，1000 rpm 离心 5 min，吸弃上清。

(5) 每管加入 1mL 0.5% Triton X-100 促渗液重悬细胞，室温孵育 10 min。

注：针对 6 孔板样本可参考每孔 1 mL 的工作液来进行，用户可以根据自己的样本情况调整用量。

(1) 配置1× Click-iT EdU反应缓冲液：用ddH2O将组分C稀释10倍。

(2) 配置 5× Click-iT EdU 缓冲液添加物（组分 E）：加 300 μL ddH2O 至 30 mg 的组分 E 试管中（终浓度 100 mg/mL），混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在-20°C，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用。

注：不同规格的组分 E 均按照此比例加 ddH2O 溶解为 5× 储液备用。

(3) 准备1× Click-iT EdU缓冲液添加物：以ddH2O稀释5× Click-iT EdU缓冲液添加物储液至1×，溶液应现配现用。

(4) 依据表 2 准备 Click-iT 工作液。

(5) 1000 rpm 离 5 min，吸弃上清，去除促渗剂，每管加入 1mL 的 1% BSA 洗涤液洗涤 2 次，1000 rpm 离 5 min，吸弃上清。

(6) 每管加入 1 mL Click-iT 工作液，混匀。

(7) 室温避光孵育 30 min。

(8) 1000 rpm 离 5 min，吸弃染色反应液，每管加入 1% BSA 洗涤细胞 2 次，1000 rpm 离心 5min，吸弃上清，用 1 mL 1% BSA 再次重悬细胞（重悬细胞的溶液体积可根据细胞的数量加以调整），流式细胞仪检测。

注：如需进行其他标志物检测可参考步骤 4。

(1) 加入抗体工作液，混匀。

(2) 避光条件下，以合适的温度及时间孵育抗体。

(1) 建议染色完成后立即进行流式检测；如果条件限制，请避光 4°C湿润保存待测，但不应超过 3 天。

(2) 检测的细胞数量建议尽量能达到百万级，若细胞数量较少，检测的细胞数量可调整为十万级起始进行实验。对于细胞得率过少（刚到万级）的情况，可能不利于做流式图，对此可适当减少步骤 5（8）中的清洗次数。

1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

2. 荧光染料均存在淬灭问题，实验操作时请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

3. Click-iT EdU 缓冲液添加物溶液最好现配现用，以保证最佳结果。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

注：（1）EdU 孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的 1/10 至 1/5，但大多数细胞系均可采用 2 h 孵育时间；

（2）考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响，细胞周期会有所变化。