Western Blot

APS: 0.1g 过硫酸铵 + 1ml 纯水, 7 天内使用, 4°C 保存

10% SDS: 10g SDS 颗粒 + 100ml 纯水

TBST: 1ml 吐温 Tween/L TBST, 搅拌 5~10min

1x 电泳液: 10x 配制 1L

1x 转膜液 (1L): 100ml 10x 转膜液, 200ml 甲醇 (20%), 700ml 纯水 (1:2:7), 回收两次就用来泡膜

封闭液配制: 2.5g 粉末, 50ml TBST (磷酸化蛋白用 BSA 较好, 其他用奶粉较好)

BSA 粉末在 4°冰箱, 配置好封闭完后要回收放在 -20°冰箱, 用一周左右 (用到嗖掉)

一抗: 用 5% BSA 配, 官网查原液: 5% BSA 配比

二抗: 1:5000, 即 1ul 的原液配 5000 倍的 TBST 或 5% BSA

曝光液: 1:1, A 液和 B 液在 4°C 中保存

孵一抗: 60~80rpm, 4°C 冰箱过夜

孵二抗或封闭: 60~80rpm, 常温慢摇

洗一抗或二抗: 150-170rpm, 常温快摇

APS 和 TEMED 最后加, TEMED

下胶加完后压胶: 95% 乙醇 / 异丙醇 / 纯水 (注意沿长板壁来回缓慢加入, 以免冲刷下胶) 等待 30min, 倒去乙醇配置上胶

注入上胶的方法同压胶, 速度要快, 然后插入梳子并补充上胶, 等待 20-25min, 注意梳子的尺寸和正反面, 配好的胶纯水保存并放入冰箱

将配好的胶装到电极槽里, 红对红, 黑对黑, 长板在外, 短板在内

倒入 1*电泳液 (工作液) 外旧内新

拔出梳子, 每个孔里加 3-5ul marker, 对照组和实验组的上样量保证一样。

(上样前将样品离心, 把管盖上的蛋白离心下来, 然后打开小涡旋机混匀样品, 上样量 15ug--50ug, 根据蛋白浓度确定上样体积, 15 孔的上样量最好不超过 25ug, 超过 25ug 用 10 孔)

调整参数, 80V (跑浓缩胶用) 30min, 120V (跑分离胶用) 60min 电泳。

以 marker 判断程度, 溴酚蓝离下端 1cm 以上, 太接近下端条带会变形。板内用新电泳液, 板外可以用旧电泳液但是不能浑浊, 总电泳液量要达到相应的最低刻度。启动电源之后要观察板内是否有气泡产生, 有可能会接触不良。建议每次 1X 的新电泳液现配现用。

倒入泡膜液, 使海绵和滤纸完全浸湿。

黑色转膜夹 (相当于负极) 在下, 1 层海绵垫, 3 层滤纸, 放胶, 再放膜, 3 层滤纸, 1 层海绵垫, 白色转膜夹 (黑胶白膜)

根据目的蛋白分子量裁剪转膜纸张, 一般为 8.5*5cm, 并在左上角剪一缺口, 标记 4321 块膜, 还有日期, 放在甲醇中活化 5min, PVDF 膜放在靠近白色转膜夹的一侧, 胶在下, 膜在上。

每放一层均用滚筒去除气泡。注意每一层之间都不能有气泡, 关上转移夹

将转膜夹放到转膜槽里, 黑对黑, 红对白 (正红负黑)。

向槽中加入转膜液, 并将电泳槽放在冰上。放置冰块到转膜槽内

倒入 1*转膜工作液, 设置参数, 转膜

1kd/min, 小分子不要用超过 250mA。大分子 280mA, 否则容易跑糊了, 电压要在 80V-130V, 液体体积达到刻度线。电泳槽外要用碎冰保持冷却, 转膜液可以回收两次, 回收之后放在 4 度保存。

用 5% 的脱脂奶粉封闭 1 小时慢摇 (常温 1h, 4 度 4 小时以上即可)

磷酸化指标要用 5% BSA 封闭慢摇

封闭液用 TBST 配置

膜再次放到 TBST 中洗 3 遍, 每一遍洗 10 分钟 (5min 即可), 摇床快摇

我们通常用 BSA 常温 1 小时, 如果没有及时敷一抗的话需要封闭完换 TBST 放 4°冰箱

一抗孵育过夜, 至少孵育 15 小时以上, 按照比例稀释抗体,

室温 TBST 清洗 3 次, 每一遍洗 10 分钟, 摇床快摇

二抗孵育 2 小时 (新配的二抗孵育 1 小时, 否则条带容易黑)

室温 TBST 清洗 3 次, 每一遍洗 10 分钟, 摇床快摇

工作液 1:1 混合, 每张膜上加入 200ul 工作液, 保证正反面都浸湿

样品和 marker 尽量放在冰上, 每次上样前用振荡器混匀 (1200 转速左右)

二抗最多用两次。回收放在负 20 度

一抗尽量放在冰上, 否则容易失效

所有物品使用要注意条件和有效期, 尤其是抗体和样品, 珍贵而且容易失效