质粒小量抽提试剂盒

温度较低时，溶液II和溶液III可能会有沉淀产生。使用前必须检查一遍。如有沉淀，37°C水浴加热溶解，混匀后使用。

溶液II有强碱性，溶液II、溶液III和溶液IV对人体有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护以避免直接接触人体或吸入体内。

本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。

溶液II使用完后，一定要盖紧瓶盖，防止被空气中二氧化碳酸化。

废液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丢弃。

取过夜菌1.5毫升，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集3毫升过夜菌沉淀。

通常大肠杆菌宜用LB培养过夜(16小时左右)至OD值为2-4。建议5000g(通常为5000rpm左右)室温离心1分钟，如沉淀不充分则适当延长离心时间。

时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密，不利于加入溶液I后散开沉淀。直接倒掉上清，再倒入约1.5毫升菌液并重复上述操作，然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸)，使液体流尽。

如果细菌密度明显偏低，可考虑使用更多菌液，再重复上述操作1-2次。对于高拷贝质粒所用菌量一般不能超过5毫升，对于低拷贝质粒所用菌量一般不能超过10毫升。过量的细菌会导致后续的裂解不充分。

每管加入250微升溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。

确认溶液I中已经添加了RNase A。最高速度vortex 5-10秒或更长时间，悬起沉淀。一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液，无明显细菌团块或絮块。

如果没有vortex，可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开或用于指把沉淀弹开。

每管加入250微升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，使细菌完全裂解，溶液透明。

切勿vortex！vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。

颠倒4-6次后，溶液应变得透明，无团块或絮状物。如果加入溶液I后细菌没有完全散开，那么颠倒4-6次后，可能还会有团块或絮状物。遇到有少量团块或絮状物产生的情况，可以增加颠倒次数3-5次，再室温放置2-3分钟，但总裂解时间不可超过5分钟。

每管加入350微升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。

切勿vortex！颠倒次数也不宜过多，否则易导致最终所得质粒的质量下降。

最高速(13,000rpm左右)室温离心10分钟。

离心后会产生白色沉淀。离心时准备好下一步需使用的质粒纯化柱，废液收集管，并在纯化柱上做好标记。

将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。最高速离心30-60秒，倒弃收集管内液体。

质粒倒入质粒纯化柱后，可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。

在质粒纯化柱内加入750微升溶液IV，最高速离心30-60秒，洗去杂质，倒弃收集管内液体。

加入溶液IV后可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。

再最高速离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。

注意：倒弃收集管内液体后再离心，才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。

将质粒纯化柱置于洁净1.5毫升离心管上，加入50微升溶液V至管内柱面上，放置1分钟。

溶液V需要直接加至管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果不慎将溶液V沾在管壁上，一定要震动离心管，使液体滑落到管底，以便被纯化柱吸收。

也可以用重蒸水或Milli-Q级纯水替代溶液V，但是水的pH应不小于6.5。溶液V加入后放置时间稍长，对于增加质粒产量会有帮助。如想得到较高浓度的质粒，可以加入35微升溶液V洗脱。

最高速离心1分钟，所得液体即为高纯度质粒。

通常所得质粒浓度为0.1-0.3mg/ml左右。如果想得到高浓度的质粒，可以采用常规的乙醇沉淀方法浓缩质粒。