RAW264.7巨噬细胞M2极化诱导与流式验证
本实验旨在通过细胞因子（IL-4和IL-13）组合刺激，诱导RAW264.7细胞向M2型（抗炎/修复型）巨噬细胞极化，并利用流式细胞术检测其特异性表面标志物CD206的表达水平，以评估极化效率，为巨噬细胞功能与免疫调控研究提供实验基础。
内容预览
实验准备
1 步骤
1.1 准备细胞与试剂
- RAW264.7细胞（P5-P10代）
- 完全培养基（DMEM高糖 + 10% FBS + 1% 双抗）
- 重组小鼠IL-4（20 ng/mL）
- 重组小鼠IL-13（20 ng/mL）
细胞复苏后，先传代培养1-2代，待其生长状态稳定后再用于正式实验。
细胞接种 (Day 0)
1 步骤
2.1 铺板与常规培养
于24孔板中接种RAW264.7细胞，密度为 2×10⁵ cells/孔。
置于37℃、5% CO₂培养箱中常规培养。
诱导前状态确认 (Day 1)
2 步骤
3.1 显微镜观察
在10倍显微镜下观察细胞贴壁与生长状况。
3.2 评估合格标准
- 细胞贴壁率 > 95%。
- 形态舒展、透亮，无明显漂浮细胞或碎片。
注意：若状态不达标，应放弃诱导，重新准备细胞。
M2极化诱导处理 (Day 1-3)
2 步骤
4.1 更换诱导培养基
小心吸弃原有培养基。
轻柔地沿孔壁加入含有 IL-4 (20 ng/mL) 与 IL-13 (20 ng/mL) 的新鲜诱导培养基。
关键提示：换液过程需避免液体直接冲击细胞层，以防机械刺激引起非特异性激活。
4.2 孵育诱导
将细胞放回培养箱，持续诱导 24小时。
24 h
持续诱导
诱导效果评估 (Day 2/3)
1 步骤
5.1 形态检查
- 细胞体拉长，呈梭形或纺锤状。
- 伪足明显，整体呈“长条状”或“毛虫样”外观。
异常情况：若细胞变圆、聚集成团或大量脱落，则表明状态异常或诱导失败。
流式细胞样本制备
2 步骤
6.1 洗涤与消化
吸弃培养基，用预冷的PBS轻柔洗涤一次。
加入适量0.25%胰酶消化1-2分钟（镜下见细胞变圆即可）。
1 min
胰酶消化
6.2 终止与离心
用完全培养基终止消化，轻柔吹打成单细胞悬液。
300g，离心5分钟，弃上清，获得细胞沉淀。
5 min
离心
表面标志物染色与检测
3 步骤
7.1 抗体孵育
| 抗体 | 标记 | 用途 |
| 抗小鼠CD206抗体 | PE | M2表型特征标志 |
| 抗小鼠CD86抗体 | FITC | M1表型对照标志 |
按1:100比例用染色缓冲液稀释抗体，重悬细胞沉淀，4℃避光孵育30分钟。
30 min
4℃避光孵育
7.2 洗涤与上机
加入PBS洗涤两次，离心弃上清。
7.3 死活鉴别与分析
死活细胞鉴别：用含有7-AAD的染色缓冲液重悬细胞，短时避光孵育，以排除死细胞干扰。
上机分析：使用流式细胞仪检测，并通过FlowJo等软件分析CD206阳性细胞比例。
关键要点与优化建议
2 步骤
8.1 状态与操作要求
细胞状态是基石：起始细胞状态直接影响诱导成功率，务必确认贴壁良好、形态健康。\n操作轻柔：所有换液、洗涤步骤需轻柔，避免物理刺激。
8.2 对照设置与试剂保存
设置合理对照：强烈建议设置未刺激对照组、同型抗体对照及单染管，以确保流式数据的准确性与可靠性。\n试剂活性：细胞因子等生物活性试剂应分装保存，避免反复冻融，建议使用前新鲜配制工作液。
来源
小白实验整理 · 官方发布
* 提示：本卡片为官方整理发布，仅用于学术研究与参考，不构成实验操作的安全指南。实验执行前请遵循您所在机构的安全操作规程（SOP）。
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